| La PCR
La «Polymerase Chain Reaction» ou PCR (ou encore ACP pour Amplification en Chaîne par Polymérase), est une technique de réplication de l’ADN. Elle permet d'obtenir, à partir d'un échantillon complexe et peu abondant, d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique et de longueur définie. L'ordre de grandeur à retenir est celui du million de copies en quelques heures. C'est, généralement, suffisant pour une utilisation ultérieure. Une PCR classique se déroule dans un tube placé dans un appareil programmable appelé thermocycleur. Le thermocycleur place le tube aux températures voulues pendant les durées programmées et recommence en effectuant des cycles. Un cycle représente trois températures différentes pendant des durées différentes. Avant la réaction, tous les « acteurs » de la PCR sont introduits dans le même tube. Il s'agit : - du fragment d'ADN à amplifier, - des amorces (ou oligonucléotides), dont la séquence est complémentaire à celle des extrémités du fragment d’ADN de manière à pouvoir s’hybrider avec elles. - de l'ADN polymérase (ici Taq polymérase) - du mélange des quatre nucléotides constitutifs de l'ADN.
Tous sont ajoutés en large excès par rapport à l'ADN. Le choix des amorces est très important car ce sont elles qui vont délimiter le début et la fin de la séquence à amplifier. . Déroulement d'un cycle : Chaque cycle de PCR est constitué de trois phases différentes à trois températures différentes : la dénaturation, l'hybridation et l'élongation. Première phase : dénaturation t = 95°c A cette température, les liaisons faibles qui assuraient la cohésion de la double hélice d'ADN sont rompues pour donner deux simples brins d'ADN. Seconde phase : hybridation t = 45-60°c L'hybridation des amorces sur l'ADN repose sur le principe de l'assemblage des bases complémentaires. Le choix de la température d'hybridation résulte d'un compromis entre plusieurs paramètres. Elle est calculée en fonction de la longueur et de la séquence des amorces. La température d'hybridation est, de toute façon, inférieure à la température de dénaturation. Troisième phase : élongation (extension des amorces) t=72°c Les amorces hybridées à l'ADN servent de point de départ à la polymérisation du brin d'ADN complémentaire de l'ADN matrice. La polymérisation se fait par ajout successif des désoxyribonucléotides (présents dans le mélange en large excès). Chaque base ajoutée est complémentaire de la base correspondante du brin matrice. Les ADN polymérases sont des enzymes qui synthétisent l'ADN de l’amorce jusqu’à la fin de la séquence d'ADN à amplifier. Les polymérases utilisées en PCR sont extraites de bactéries vivant naturellement à des températures élevées. Ces polymérases ne sont donc pas dénaturées par la chaleur. La plus connue est la Taq polymérase. La polymérisation ne s'arrête pas lorsque la copie est de la longueur souhaitée car la Taq polymérase poursuit la synthèse au-delà de la longueur souhaitée. La copie de l'ADN initial génère donc des copies plus longues que souhaitées. Ce cycle va se répéter de multiples fois, doublant à chaque cycle le nombre de doubles hélices d’ADN, afin de pouvoir en prélever un maximum pour les étapes suivantes. Une fois L'ADN amplifié les scientifiques lisent le code génétique grâce à l'éléctrophorèse (clic) Supprimer les publicités sur ce site pendant 1 an
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